Isolasi DNA Total Tanaman

Mengapa saya membagikan tulisan ini ? karena beberapa waktu yang lalu dikantor saya diadakan In House Training Polymerase Chain Reaction (PCR), selain itu kuliah saya di Biologi juga membahas materi ini tepatnya di matakuliah Biokimia. Sumber tulisan saya dapat dari generasibiologi.com. Di situs tersebut dijelaskan secara detail mengenai langkah-langkah isolasi DNA tanaman. Dan bagi siapapun yang sedang mencari tulisan tentang isolasi DNA tanaman, semoga blog ini bisa membantu.

Asam nukleat terdiri dari 2 jenis golongan, yaitu RNA dan DNA. DNA merupakan struktur dasar makhluk hidup yang membawa informasi genetik, yang terdapat pada sel prokaryota, eukaryota, ataupun virus. DNA dapat berupa DNA kromoson dan DNA plasmid, selain itu DNA juga terdapat di mitokondria dan kloroplas. Elektroforesis melalui gel agarose atau akrilamid merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan suatu potongan DNA. Buffer yang biasa digunakan dalam elektroforesis gel agarose adalah TAE dan TBE.

Isolasi total DNA tanaman

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat. Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran yaitu dengan cara menggerus masing-masing daun tanaman dengan bantuan nitrogen cair dan pasir kuarsa.

Proses selanjutnya adalah penambahan larutan penyangga lisis dalam hal ini menggunakan Cetyl Trimethylammonium Bromide (CTAB). Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA bersifat insoluble pada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. 

Proses selanjutnya adalah menginkubasikannya pada suhu 65°C selama 2 jam. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15°C. Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan Rhizobium (Surzycki, 2000). Dalam penggunaan buffer CTAB ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan ß-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida sementara ß-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). ß-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008). Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebskiet al., 1997). Penggunaan ß-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi protein yang mengkontaminasi DNA (Walker dan Rapley, 2008). Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Chloroform isoamyl alkohol digunakan untuk mendenaturasi protein. Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform – air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Clark, 2010). Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni. Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Surzycki, 2000). 

Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi.Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer, 1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi. 

Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA. 

Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular. Pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat.Proses presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian kembali pellet yang dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et al., 2003). 

Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka etanol kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol dilakukan dengan cara evaporasi karena etanol mudah menguap (Surzycki, 2000). Pada tahap pencucian biasanya etanol dicampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu memisahkan kontaminan yang tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang terikat pada asam nukleat (Sambrook et al., 2001). 

Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer TE ke dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20ºC. Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20ºC. 

Elektroforesis gel agarose

Elektroforesis DNA umumnya menggunakan metode elektroforesis gel agarosa (Karp, 2008). Metode elektroforesis tersebut pada prinsipnya melibatkan fase stasioner yang berupa gel agarosa dan fase gerak berupa buffer Tris-acetate EDTA (TAE) atau Tris-borat EDTA (TBE) (Switzer, 1999). TBE (Tris-borat EDTA) 1X, Tris/Borat adalah buffer yang umum digunakan sebagai buffer elektroforesis karena memiliki kapasitas buffering yang tinggi pada titik isoelektriknya (Ausubel, et al., 2003). Borat bertindak sebagai conducting ion sehingga dapat mempertahankan kesetimbangan ion H+ dan OH- yang dihasilkan oleh elektroda, hal ini berhubungan dengan fungsi buffer dalam menjaga kesetimbangan pH saat migrasi fragmen DNA berlangsung, perubahan pH dapat mendenaturasi struktur DNA sehingga mengubah elektromobilitas DNA (Martin, 1996).

Agarosa merupakan polisakarida turunan yang didapat dari alga merah (Miesfeld, 1999). Gel agarose dapat digunakan untuk memisahkan DNA berukuran lebih dari 100 bp, sedangkan untuk memisahkan DNA dengan ukran lebih pendek dapat digunakan gel poliakrilamid (Wilson dan John, 1994). Gel agarose merupakan fase diam dalam pemisahan fragmen DNA, konsentrasi agarose yang digunakan dalam pemisahan fragmen DNA sangat mempengaruhi mobilitas fragmen DNA, semakin besar konsentrasi agarose yang digunakan maka semakin kecil pori-pori gel, dan semakin kecil konsentrasi agarose maka semakin besar pori-pori gel. Perangkat dalam elektroforesis gel agarosa diantaranya terdiri dari power supply sebagai sumber arus listrik; cetakan gel; sisir yang digunakan untuk membuat sumuran tempat peletakan DNA yang akan dielektroforesis. Pembuatan sumuran ini dilakukan dengan meletakkan sisir pada gel sebelum gel memadat; tangki elektroforesis; dan elektrode(Martin, 1996). 

Pemisahan fragmen DNA berdasarkan elektromobilitas berguna sebagai metode analitik maupun preparatif, molekul DNA yang bermuatan negatif karena adanya gugus fosfat akan bergerak menuju anode (elektrode bermuatan positif) saat dipisahkan dengan elektroforesis (Miesfeld, 1999). Fragmen DNA yang memiliki ukuran molekul yang sama akan memiliki elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak migrasi yang sama pula (Gilbert, 2000). Proses running elektroforesis DNA sampel bersamaan dengan DNA yang telah diketahui ukurannya (standard) dapat berguna dalam analisis besar ukuran DNA dalam sampel (Switzer, 1999).

Maloy et al. (1994) menjelaskan bahwa topologi DNA yang dipisahkan menentukan elektromobilitas DNA. DNA yang mengalami supercoil akan bermigrasi lebih cepat karena strukturnya sangat kompak. DNA yang akan dielektroforesis pada umumnya dicampur dengan loading dye yang berfungsi untuk memonitor mobilitas elektroforesis, loading dye bermigrasi bersama molekul DNA selama proses running elektroforesis. bromphenol blue dan xylenecyanol merupakan jenis loading dye yang umum digunakan dalam elektroforesis DNA, bromphenol blue dapat bermigrasi bersama dengan molekul DNA berukuran 0,5 kb sedangkan xylenecyanol dapat bermigrasi bersama molekul DNA berukuran 5 kb (Ausubel et al., 2003).  

Hasil elektroforesis dapat divisualisasi dengan menggunakan pewarna fluoresensi ethidium bromide (EtBr) (Gilbert, 2000) atau bromophenol biru. Secara teknis, setelah proses running, gel direndam dalam larutan buffer TBE atau TAE yang mengandung ethidium bromide, selanjutnya ethidium bromide akan berdifusi ke dalam gel dan berasosiasi dengan DNA (Switzer, 1999). Ethidium bromide mampu berinterkalasi diantara pasang basa nukleotida pada struktur double heliks dan saat gel hasil elektroforesis disinari dengan ultraviolet maka fragmen-fragmen DNA yang telah terpisah tampak sebagai band-band berwarna oranye (Campbell dan Shawn, 2009).